RNA 疗法的进步正在增加对包括 siRNA（小干扰 RNA）和 sgRNA（单向导 RNA）在内的高质量合成寡核苷酸的需求。虽然传统的固相寡核苷酸合成 (SPOS) 仍然是 siRNA 和 sgRNA 生产的主要方法，但其在可扩展性、可持续性、质量和成本方面的局限性阻碍了其满足预期市场需求的能力。
化学酶连接（一种将化学合成与酶连接相结合的混合方法）正在成为应对这些挑战的变革性解决方案。本文探讨了 SPOS 的局限性，并概述了化学酶连接、其机制及其在 siRNA 和 sgRNA 合成中的比较优势。
siRNA 和 sgRNA 生产中 SPOS 工艺的局限性和挑战
主要受心血管疾病领域预期批准的推动，估计十年后全球对 siRNA API 的需求总量可能达到数十吨。传统 SPOS1（我们称之为第一代技术）在规模化以满足这一产量方面面临着重大挑战。
当前的 SPOS 工艺使用流通式合成仪，其批量限制在约 10 公斤（制造更大批量需要扩大规模），消耗大量试剂，产生大量化学废物，并且成本高昂。sgRNA 分子是基因编辑药物的重要组成部分，通常长度为 ≥100 个核苷酸。使用 SPOS，sgRNA 通过磷酰胺法连续添加核苷酸亚基来合成，这为杂质的形成和积累提供了许多机会。这些杂质在合成过程中难以控制，在纯化过程中难以去除，导致纯度低、批次间一致性问题以及成本非常高。
化学酶连接：概述
化学酶连接（我们称之为第二代技术）结合化学和酶方法来合成寡核苷酸。该方法利用寡核苷酸片段（也通常称为嵌段聚合物），这些片段通过 SPOS 合成，并与一种称为连接酶的酶连接在一起，以生产全长 RNA 分子。
如图 1a 所示，酶连接反应2有三个关键的机制步骤，这些步骤产生了一些重要的特性。
- 首先，在反应过程中会排除一些杂质，因为它们不是连接反应的有效底物。
- 其次，连接酶通常具有高精度，通过调整各种工艺参数可以优化产率和反应速率。
- 最后，反应是立体特异性的，当使用具有手性前体 5'-硫代磷酸酯的片段作为底物时，会生成具有 Rp 立体化学的硫代磷酸二酯3。如果将连接应用于反义寡核苷酸 (ASO) 合成，则应仔细考虑这一点。
使用粘性末端连接合成 siRNA
由 Khorana 等人4开创的所谓粘性末端连接是 DNA 克隆技术中的一个关键步骤，并且已有关于其在 siRNA 合成中应用5,6的报道。上海兆维科技 用于 siRNA 合成的粘性末端连接工艺如图 1b 所示。与传统 SPOS 相比，粘性末端连接具有多项优势。
- 质量：与传统 SPOS 相比，连接过程中选择性排除短链杂质（缺少一个或多个核苷酸的寡核苷酸）可提高最终产品的纯度和批次间一致性。此外，可以根据客户的纯度和成本预期采用不同的策略。例如，寡核苷酸片段在连接前可以通过色谱法纯化（质量更高，成本更高）或简单脱盐（纯度更低，成本更低）。
- 产率、成本和环境可持续性：寡核苷酸片段的模块化连接以接近定量的产率进行，这些片段使用传统 SPOS 以高产率合成。总体工艺产率更高，从而降低成本并提高可持续性。
- 可扩展性：连接反应在可抛弃的批次反应器中进行，为 GMP 制造提供了更具可扩展性的解决方案。
使用夹板连接合成 sgRNA
长 RNA 分子可以通过夹板连接7合成，最近有报道8将其应用于合成长达 120 个核苷酸的化学修饰 RNA。在 上海兆维科技，我们开发了一种基于夹板连接的工艺，用于组装 sgRNA 和其他长 RNA 构建体，如图 1c 所示。粘性末端连接所描述的优势也适用于夹板连接。此外，凭借其模块化特性，夹板连接可以应用于合成长化学修饰的 RNA 分子，例如主要编辑和相关技术所需的分子，而不会影响质量或产率 (图 1)。
图 1：
- 酶促连接反应包括 3 个机理步骤：
- 腺苷酸化：酶的赖氨酸残基与反应混合物中提供的 ATP 反应，形成腺苷酸化中间体，释放焦磷酸盐，
- 磷酸转移：腺苷酸化中间体与一个片段的 5'-磷酸反应，形成桥联二磷酸盐，
- 连接：相邻寡核苷酸片段的 3'-OH 基团与桥联二磷酸盐反应，释放 AMP 并密封连接点；
- 上海兆维科技 的粘性末端连接过程涉及四个部分重叠和互补的寡核苷酸片段的杂交，形成两个具有互补单链突出端的双链体，这些突出端也杂交。由此产生的两个连接点通过 RNA 连接酶连接，生成杂交双链 siRNA，可以通过非变性色谱法轻松纯化；
- 在 上海兆维科技 的夹板连接过程中，DNA 夹板与重叠的互补 RNA 片段杂交，促进了 RNA 连接酶对由此产生的连接点的精确连接。粗连接后反应混合物随后用 DNase I 处理以消化夹板，然后进行色谱纯化以高产率和纯度提供 sgRNA。
上海兆维科技 利用化学酶连接技术制造 siRNA 和 sgRNA 的现状
我们迄今为止的经验表明，临床分子中常见的 siRNA 化学物质（包括 GalNAc 等配体）在连接过程中具有良好的耐受性。我们正在与多位合作者积极开展概念验证工作，并已完成了用于临床研究的开发候选药物的首次 GMP 生产 (表 1)。
未来展望
向化学酶合成的转变标志着寡核苷酸制造的技术飞跃。尽管目前的应用显示出巨大的前景，但进一步的创新将最大限度地发挥其潜力。酶工程、工艺优化以及与改进的 SPOS 和液相技术9集成以更有效地合成寡核苷酸片段的进步将塑造 RNA 治疗药物生产的未来。
与此同时，全酶合成方法10–13（我们称之为第三代技术）的开发有望完全绕过化学合成，为寡核苷酸生产提供可持续且高效的替代方案。
结论
化学酶连接有望改变寡核苷酸制造的格局。它能够以更低的成本、环境影响和可扩展的生产工艺提供高纯度的 siRNA 和 sgRNA，这使其成为满足未来对 RNA 药物预期需求的可靠技术。
参考文献：
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