P(V) 寡核苷酸合成平台的创新改进，助力寡核苷酸药物开发！

01 挑战

构象异构体的控制与药物稳定性

寡核苷酸规模化合成长期依赖亚磷酰胺P(III)和四步循环合成法，包括脱保护、耦合、氧化和封闭。然而随着寡核苷酸治疗的发展，传统的P(III)四步循环法面临着越来越多的挑战。其中最有代表性的挑战之一就是硫代磷酸酯键（PS）寡核苷酸的构象控制。

P(III)四步循环法不能控制PS键的立体构象，会产生R (Rectus，顺时针) 和S (Sinister，逆时针) 两种PS键的绝对构型。以反义寡核苷酸 (ASO) 药物Spinraza为例，这款药物的18个核苷全都由PS修饰骨架连接，理论上拥有2¹⁷= 131, 072种异构体。如此庞大的异构体数量给PS寡核苷酸药物的开发和质量控制带来了极大的不可预测性。

02 机遇

控制PS构象的P(V)合成手段：Ψ试剂

2018年，斯克里普斯研究所 (Scripps) 和百时美施贵宝公司 (BMS) 在Science上发表了首个使用五价磷“P(V)”合成PS寡核苷酸的新技术：Ψ试剂  (Ψ=PSI, 即Phosphorus−Sulfur Incorporation)。

Ψ试剂由三部分组成：手性骨架（氧化柠檬烯）、P(V)-S中心和离去基团（五氟苯硫酚）。该试剂为固相PS寡核苷酸合成带来了两项改进：

1. (1) 手性支架能够控制PS键的绝对构型。
2. (2) 使用P(V)化学代替P(III)亚磷酰胺，避免了氧化/硫化步骤，从而简化了固相合成。

然而，在实际大规模生产中，实施Ψ试剂仍然存在一些挑战：

1. (1) Ψ试剂的材料成本高昂。Ψ试剂的离去基团非常昂贵（约3000美元/公斤）。
2. (2) 偶联步骤中使用的强有机碱DBU（1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯）可能导致固相载体连接臂断（Linker）裂，降低产率和纯度。
3. (3) Ψ试剂需要非商业化的核碱基保护基团，难以适用大规模生产。

03 优化与升级

可规模化寡核苷酸合成平台：Ψ^Br

为了解决上述问题，研究人员系统地研究了Ψ试剂的离去基团、固相载体连接臂（Linker）和核碱基保护基团，从而开发出了一种改进的合成平台：Ψ^Br。

如图1A所示，首先对Ψ试剂的离去基团进行了改进，将昂贵的五氟苯硫酚替换为了更易获得的4-溴苯硫酚（后者成本不到前者的十分之一）。此外，更换这一离去基团不影响核苷单体的合成，也和Ψ试剂一样通过手性骨架来控制构象（图1，B）。

图1. Ψ^Br试剂的更低成本和可控立体化学。
(A) 现有Ψ试剂与Ψ^Br试剂离去基团的对比和材料成本。氧化柠檬烯手性支架用黑色标记，P(V)-S中心用黄色标记，Ψ试剂离去基团用红褐色标记，Ψ^Br试剂离去基团用绿色标记。
(B) Ψ^Br试剂两种构象的X射线表征结构。(+)代表右旋异构体，(-)代表左旋异构体。紫色棒状中心代表P(V)原子。

其次，研究人员对固相载体连接臂（linker）进行了改进，目的是提升linker在DBU环境中的稳定性。

如图2，A所示，标准的succinate（琥珀酸，#12）linker会在耦合步骤时被DBU断裂，导致生产效率和纯度的降低。为了建立Ψ^Br合成平台，研究人员将#12与其他三种linker进行了比较（图2，B），包括#11 (Sar-Glu) 、 #13 (Q) 和#14 (PEG4) 。在耦合过程所需的DBU环境下，80%以上的#12在20轮耦合后就断裂了（图2，C）。相比之下，#11和#14表现出更好的稳定性，即使经过120个偶联循环，仍有80%以上的连接臂没有被断裂。因此，最终选择连接臂#11（Sar-Glu）作为Ψ^Br合成平台的固相载体连接臂。

图2. 四种固相载体连接臂的比较。
(A) 有机强碱DBU断裂固相载体linker。灰色棒状为固相载体UnyLinker，深红色圆为核苷单体，箭头为电子转移路径（酰胺去质子化）。 
(B) 研究人员选择比较的四种linker：#11（Sar-Glu），#12（succinate），#13（Q）和#14（PEG4）。灰色标记的化学键为linker部分。 
(C) 四种linker在120次耦合过程中的稳定性。纵坐标为完整linker的比例，横坐标为耦合次数。

最后，研究人员筛选了适用于Ψ^Br合成平台的A、C、G、T碱基的核碱基保护基团（图3）。

现有的Ψ试剂需要搭配POM和Pya碱基保护基。这两种保护基不仅需要定制合成（尚未规模化），也需要保护全部四种碱基，包括没有活性氨基位点的T。而基于新Ψ^Br试剂和Sar-Glu linker进行了碱基保护基筛选，发现即便使用常规的iBu、Bz和dma保护基也可以达到相同的效果，尤其是T可以无需保护基。这三种保护基早已达到吨级生产规模，更有利于工业放大。

正如图3中的色谱图所示，使用新Ψ^Br试剂、Sar-Glu linker和三种常见保护基所得的两种构型控制PS寡核苷酸（Rp-19和Sp-19）与现有的Ψ试剂得到的产物一致，都有极高的纯度。这一结果证明了Ψ^Br合成平台的可行性。

图3. Ψ^Br合成平台中使用的常规核碱基保护基团。虚线框内显示了Ψ试剂所搭配的定制碱基保护基POM和Pya（叔丁酰氧甲基和1-甲基吡咯烷-2-亚胺基，红棕色），Ψ^Br合成平台选择的常见保护基，包括G保护基iBu（异丁酰基，粉色），C保护基Bz（苯甲酰基，蓝色）和A保护基dma（二甲基乙酰胺基）。而T无需保护（黑色）。棕红色上折线为R构型PS（Rp），深蓝色下折线为S构型PS（Sp）。下图左侧为Ψ试剂搭配的POM和Pya保护基合成的全PS修饰序列，包含R和S两种构型的选择性控制。右侧为Ψ^Br合成平台使用iBu、Bz和dma合成的相同序列。

04 结论

基于Ψ试剂的P(V)合成相比P(III)具有PS构型选择控制和避免氧化步骤（三步循环）等优点。Ψ^Br合成平台进一步实现了：(1) 更低的原材料成本； (2) 更稳定的偶合； 和 (3) 更简单的核碱基保护。Ψ^Br有望成为一种容易工业放大且产率更高的PS选择性控制合成平台，为寡核苷酸药物生产带来了新的强大工具！