CRISPR-Cas技术在基因编辑领域的广泛应用，正在推动sgRNA合成需求的快速增长。然而，传统的SPOS（solid-phase oligonucleotide synthesis, 固相合成寡核酸）法难以匹配这一需求增长。其原因是SPOS法用于长达约100 nt的sgRNA时，难以确保sgRNA引导区的保真度（fidelity）。不仅如此，由于sgRNA具有高密度的化学修饰和复杂的二级结构，SPOS法也难以达到较高的纯度和产率。
经过精心布局，兆维科技深入开发的酶连接（Ligation）合成技术已用于双价siRNA高纯度合成（详见案例上篇）。本文作为该技术运用案例的下篇，将继续介绍兆维科技的sgRNA合成案例，旨在展示两步酶促连接方法如何确保sgRNA引导区的高保真度，并突出酶促连接技术在基因编辑药物开发领域的潜力！
由Intellia Therapeutics开发的sgRNA能引导CRISPR-Cas对TTR（transthyretin，转甲状腺素蛋白）基因的编辑，实现hATTR（hereditary transthyretin amyloidosis，遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性）的治疗。本案例重点研究Intellia G211 sgRNA。其结构包括与靶基因互补的引导区、重复/反重复（repeat/anti-repeat）区以及含有多个茎环的结构稳定区（图1）。它的一大特点是在多个位置引入2'-OMe修饰，并在两端引入PS（phosphorothioate，硫代磷酸酯）修饰。这些修饰可显著增强其在体内的稳定性与活性。
然而，G211 sgRNA的复杂性给SPOS方法带来了以下挑战：（i）因为SPOS法是由3’端→5’端的方向进行，所以20 nt引导区的合成发生在SPOS流程的末期。由于反应步数的累加，这段序列的保真度就难以控制，也意味着脱靶风险；（ii）SPOS法合成100 nt的G211 sgRNA需要约400步反应，这会导致SPOS产生的sgRNA杂质极为复杂，也会降低sgRNA的产率。
不同于SPOS一次性合成100 nt，上海兆维科技的双步酶连接法将sgRNA分成了3条片段（图1），每段只需SPOS一次性合成40 nt。因此，每条片段的杂质会更加简单，其纯度和产率也会更高。不仅如此，将sgRNA分割为3条片段分别合成也能减少二级结构对SPOS的干扰。最为重要的是，双步酶连接法还包括了独立的引导区酶连接步骤，以此确保引导区的保真度。
引导区的酶连接合成过程包括以下步骤：
- 第一，通过SPOS合成两个引导区片段（片段1A和1B）和一个20 nt DNA模板（模板1*）（图2，A）。
- 第二，片段1A和1B与模板1*互补杂交形成连接位点（图2，B）。
- 第三，使用连接酶连接1a和1b，形成完整的片段1（图2，C）。
- 第四，使用DNase降解DNA 模板1*，留下RNA片段1（图2，D）。
如图3，A所示，完成片段1的合成后，通过SPOS合成另外两个片段（片段2和3），然后合成2个DNA模板（模板1*2*和2*3*）去连接片段1、2和3。在模板的辅助下，三条片段的酶连接是通过一锅法完成的。最后再用DNase降解2条模板，得到完整的sgRNA。
片段1和2都和模板完全互补，而片段3仅与模板部分互补，原因包括：（i）若完全互补，模板2*3*长度需要增加至60 nt，这会导致其合成纯度和产率的下降；（ii）模板2*3*的长度已足够确保其与片段3的互补特异性，排除杂质的干扰。
兆维科技为模板和片段选择了不同的纯化策略。如图三B所示，所有的片段都采用了HPLC纯化，但模板仅采用UF/DF（ultrafiltration/diafiltration，超滤/渗滤）。这么做的原因是sgRNA产物的纯度主要由片段1-3决定，而且模板杂质最终会被DNase降解。可以看到即便模板1*2*的纯度只有70.4%，sgRNA产物的纯度也高达96.8%（DNAse降解和HPLC纯化后）。而省去模板的过柱纯化可以减少合成成本。
在本案例中，酶连接合成双价G211 sgRNA展现了以下特点和优势：
- 引导区的高保真度。双步酶连接法是将引导区的酶连接作为第一步，完整sgRNA的酶连接作为第二步。这种策略能将引导区的SPOS合成长度压缩到10 nt左右，从而实现极高的纯度（>98%，图3，B），并进一步实现引导区的高保真度。
- 更高的sgRNA纯度。两步法实现了96.8%的纯度，远高于SPOS能够得到的纯度（60-80%）。不仅如此，酶连接法通过大幅度降低SPOS的合成长度（100 nt → 40 nt），也能减少sgRNA杂质的复杂性。
- 更高的产率和更低的成本。与双价siRNA的情况类似（详见案例上篇），sgRNA采用酶连接合成能得到更高的终产品产率。此外，酶连接法也能大幅度降低SPOS的试剂消耗，并减少生产成本。
- 灵活的模块化合成特性。本案例采用的两步酶连接法验证了模块化合成的可行性。如有必要，可以对其他片段采用独立的酶连接步骤，从而确保特定片段的高纯度和高保真。该策略亦具备良好的扩展性，有望应用于更复杂RNA结构的合成，例如pegRNA（prime editing guide RNA，引物编辑向导RNA）。
如今，随着基因编辑技术从实验室快速走向临床应用，酶促连接技术正成为突破长链sgRNA合成瓶颈的关键途径。通过其分步合成策略，上海兆维科技的酶促连接技术不仅显著提高了sgRNA的纯度和产率，而且确保了引导区的高保真度。
上海兆维科技正在进一步将酶促连接技术应用于更长的sgRNA分子，例如长度可达250 nt的pegRNA。这类RNA在引导区的基础上融合了逆转录模板，对合成精度和结构完整性要求更高。我们相信双步酶连接法的高度灵活性会使其成为pegRNA工业化合成的最具潜力方案之一。随着未来CRISPR治疗方式的多样化，双步酶连接法将在基因编辑领域开启更广阔的应用空间！
2024年9月，上海兆维科技与美国CDMO服务提供商ReciBioPharm达成战略合作。泓迅科技用于合成高纯度sgRNA的酶促连接技术将赋能ReciBioPharm，为基因编辑药物开发带来更高质量的产品和更高效的解决方案！